随着越来越多CRISPR基因编辑工具进入临床实验，检测脱靶编辑对于安全至关重要。已有的检测方法主要集中在向导RNA（gRNA）与基因组序列之间的错配，忽略了细胞内基因组DNA天然存在的复杂三维拓扑结构对脱靶编辑的影响。

近日，高致病性病毒与生物安全全国重点实验室/武汉大学医学研究院张楹团队在Nature Chemical Biology发表了题为TOPO-seq reveals DNA topology-induced off-target activity by Cas9 and base editors的研究论文，建立了一种可以捕捉拓扑结构引起的全基因组脱靶编辑的新方法（TOPO-seq）

研究团队前期发现DNA拓扑结构不仅调控Cas9识别靶标序列的特异性，也影响编辑效率（Mol Cell, 2022）。为了进一步探究拓扑结构是否影响脱靶编辑，研究者建立了一种可以捕捉拓扑结构引起的全基因组脱靶编辑的新方法（TOPO-seq）。利用TOPO-Seq在多个临床gRNA和治疗相关细胞中，检测出大量由于拓扑结构所引起的脱靶位点。进一步分析发现，这些拓扑结构所引起的脱靶含有更多的错配序列，且呈现细胞特异性。这一发现提示了必需在治疗相关的细胞中进行全面的脱靶检测，以确保治疗效果和安全性。基因编辑治疗具有不可逆的特性，一旦编辑产生，就无法逆转。如果脱靶编辑发生在癌基因附近，很可能导致基因疗法临床试验的失败。建立的TOPO-seq方法（图1）不仅能够灵敏地检测基因编辑工具在不同DNA拓扑构象中的脱靶风险，还能够评估临床相关细胞中的脱靶情况，为基因编辑工具的安全性和临床转化提供了可靠的技术支持。

图1 TOPO-seq检测示意图

TOPO-seq由两步构成。第一步，检测体外脱靶位点。将基因组随机打断并构建环化文库。通过在环化过程中加入不同浓度的溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）制备出不同负超螺旋密度的环状DNA文库，以模拟细胞内多变的拓扑状态。进而，将不同拓扑结构的环状DNA文库分别与基因编辑工具进行体外编辑，通过测序鉴定脱靶编辑位点。第二步，在治疗相关的细胞内，利用多重PCR验证真实脱靶位点

总之，TOPO-seq 揭示了 DNA 拓扑结构对 Cas9 及碱基编辑器脱靶活性的显著影响，且可检测出传统方法（GUIDE-seq和Digenome-seq）遗漏的高风险位点，检测灵敏度更高，为基因编辑技术的安全性评估提供了新视角和新工具。研究强调了，在基因编辑工具的临床前评估中，需充分考虑 DNA 拓扑结构对脱靶效应的潜在影响，针对特定细胞类型进行脱靶评估，以确保临床应用的安全性。

武汉大学博士后段敏、博士生高盼和张逸舟为共同第一作者。武汉大学张楹教授为通讯作者。本研究获得武汉大学化学与分子科学学院郭存兰教授、医学研究院殷昊教授和武汉大学医学研究院仪器设备共享中心的帮助。本工作得到了高致病性病毒与生物安全全国重点实验室、泰康生命医学中心、教育部免疫与代谢前沿科学中心、武汉大学中南医院的大力支持，得到了卫健委重大项目计划和科技部重点研发计划的资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-025-01867-7